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Aug 22, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 12151 (2023) Citar este artículo

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La nicotina es un alcaloide altamente adictivo y un neuroestimulador que se encuentra en el tabaco y que causa adicción en los humanos y convierte al tabaco en un producto comercial de alta demanda. Se utiliza popularmente con fines recreativos y es una sustancia nociva (el valor LD50 oral para ratas es de 50 mg/kg) y causa adicción. Los metabolitos de la nicotina, como las nitrosaminas específicas del tabaco (TSNA), son sustancias peligrosas cuyos metabolitos son altamente electrófilos y forman aductos de ADN, que iniciarán el proceso de carcinogénesis. Los TSNA se forman durante el curado, almacenamiento y fermentación debido a la nitrosación de la nicotina y otros alcaloides del tabaco. Los TSNA se utilizan como biomarcadores para la evaluación del riesgo de cáncer en humanos expuestos al tabaco y sus productos. Para determinar la formación ocasional de TSNA en insectos que se alimentan de tabaco, se analizaron larvas del quinto estadio de Spodoptera litura y sus heces para detectar la presencia de N′-nitrosonornicotina (NNN), 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)- 1-butanona (NNK) y 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanol (NNAL) junto con las hojas de tabaco almacenadas (PT-76) usando un sistema LC-MS/MS Agilent 6470B siguiendo Protocolo ISO/DIS 19290:2015. Las larvas se extraen en una extracción tamponada con acetonitrilo y agua y la cantidad de TSNA se cuantifica en el modo de monitoreo de reacciones múltiples (MRM). Se inyectaron 20 \(\upmu\)l de cada muestra extraída y limpiada en el sistema LC-MS/MS para su cuantificación. El límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) fueron 0,001 mg/kg y 0,005 mg/kg para todas las nitrosaminas analizadas. Se encontró que el NNN era de 0,361 mg/kg, 0,340 mg/kg y 5,66 mg/kg en muestras de cuerpo entero de insectos, heces y hojas de tabaco, respectivamente. Se encontró que NNK era de 0,060 mg/kg, 0,035 mg/kg y 0,93 mg/kg en muestras de cuerpo entero de insectos, heces y hojas de tabaco, respectivamente. Sin embargo, no se detectó NNAL ni en todo el cuerpo ni en las heces del insecto. Las recuperaciones oscilaron entre el 95 y el 98 % para todos los compuestos cuando se agregaron a LOD y LOQ. La presencia de TSNA es un biomarcador de riesgo de cáncer y su presencia en insectos apuntaría a una evaluación del riesgo de cáncer en insectos que se alimentan de tabaco y a cualquier posible vía de desintoxicación de TSNA en insectos que podría prevenir la mutagénesis causada por estos compuestos.

Las nitrosaminas específicas del tabaco (TSNA) son un grupo de carcinógenos que se encuentran en el tabaco y los productos del tabaco1. Se forman durante el curado, almacenamiento y fermentación del tabaco mediante nitrosación de alcaloides del tabaco como nicotina, nornicotina, anabasina y anatabina. Los TSNA no están presentes en las hojas frescas de tabaco y su formación comienza unos días después de la cosecha2,3,4. Los TSNA incluyen 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK), N'-nitrosonornicotina (NNN), N'-nitrosoanabasina (NAB) y N'-nitrosoanatabina (NAT). Los dos primeros son carcinógenos potentes (Grupo 1, altamente cancerígenos) y se cree que están asociados con la mayoría de los cánceres de pulmón en fumadores5,6. Boyland et al.7,8 fueron los primeros en demostrar la actividad cancerígena de NAB en ratas y NNN en ratones. Se ha informado que NNN y NNK causan tumores esofágicos, tumores del epitelio olfatorio, tumores traqueales, adenomas de pulmón y adenocarcinomas en diferentes animales, así como en humanos6,9. El 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanol (NNAL) es un metabolito de NNK y se ha informado que causa cáncer de pulmón en humanos. Los pacientes con cáncer de pulmón tenían niveles significativamente más altos de NNAL10 en orina. El consumo de tabaco en cualquier forma expone a los seres humanos al riesgo de contraer cáncer.

Los insectos que se alimentan de tabaco no se ven afectados por los compuestos mutagénicos presentes en las hojas de tabaco. Los experimentos con insectos que se alimentan de tabaco sugirieron que en la mayoría de los insectos la nicotina no es metabolizada por los insectos o la nicotina y otros alcaloides del tabaco probablemente dañinos son rápidamente excretados por los insectos antes de que se acumulen concentraciones letales11,12. Las investigaciones para determinar el metabolismo de la nicotina en el gusano córneo del tabaco, Manduca sexta, revelaron que la nicotina se metaboliza en N-óxido de cotinina y se excreta rápidamente junto con la nicotina libre que no se metaboliza13. Se cree que las enzimas del intestino medio como las monooxigenasas del citocromo P450 y las glutatión S-transferasas son responsables de la rápida excreción de nicotina en Helicoverpa assulta14,15. La presente investigación tuvo como objetivo la determinación de TSNA y su destino en un insecto que se alimenta de tabaco, Spodoptera litura, comúnmente conocido como gusano cortador del tabaco. Las hojas de tabaco fermentadas en el intestino de este insecto deberían dar como resultado la formación de TSNA tal como se forman durante el curado y la fermentación de las hojas de tabaco. Esta es probablemente la primera vez que se analizan TSNA en insectos.

Se utilizaron técnicas cromatográficas para separar y cuantificar analitos de mezclas de compuestos en una solución. Pero acoplar la espectrometría de masas a las técnicas cromatográficas ha hecho que el procedimiento de análisis sea muy preciso. La espectrometría de masas (MS) utiliza carga-masa (m/z) de modo que cualquier fragmento de ion formado durante el proceso de ionización no pase desapercibido16. Especialmente, los MS equipados con triples cuadrupolos pueden ser muy específicos para detectar muchos analitos específicos. Esto se denomina monitoreo de reacciones múltiples (MRM), que hemos utilizado para analizar TSNA en larvas de S. litura. Varios investigadores utilizaron este método para analizar la nicotina y otros compuestos nocivos derivados del tabaco en matrices biológicas. Alasmari et al.17 utilizaron UPLC-MS/MS para cuantificar la nicotina y la cotinina en suero de ratones. Las vías metabólicas también se pueden dilucidar utilizando estas técnicas cromatográficas cuando se combinan con espectrometría de masas. Yin et al.18 utilizaron desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) de resolución ultraalta para estudiar los metabolitos del fármaco simvastatina en fluidos corporales de ratas. Amer et al.19 utilizaron el método LC-MS/MS para cuantificar un fármaco llamado Masitinib en matriz de microsomas de hígado de rata y orina de rata. El metabolismo de los fármacos y las vías asociadas con su metabolismo se pueden estudiar mediante LC-MS/MS20,21,22. El presente estudio también utiliza LC-MS/MS para analizar TSNA en la oruga que se alimenta de tabaco, S. litura.

Se utilizó metanol, acetato de amonio (E. Merck, India Ltd.), kit de extracción Agilent QuEChERS (p/n 5982-5755CH) y kit SPE dispersivo (p/n 5982–5022) para extraer las muestras y los estándares internos de NNN. y NNK adquiridos se mencionan a continuación en la Tabla 1. Se usó agua Milli-Q para la preparación de las muestras.

Las semillas de tabaco (PT 76) se adquirieron en el mercado local, Samastipur, y se sembraron en macetas. Se recolectaron larvas de S. litura de los campos de tabaco y se criaron en hojas de tabaco (PT 76) durante cinco generaciones en condiciones controladas (25 ± 1 °C; 70% HR). Se encontró que todas las etapas de la vida de cinco generaciones eran saludables y libres de malformaciones. Las larvas del quinto estadio de S. litura de la quinta generación y sus heces se recolectaron y almacenaron a -20 ° C en un congelador. Se recolectaron hojas de tabaco y se almacenaron a -20 °C en un congelador durante 3 días para permitir la formación de TSNA.

El método de extracción se siguió según lo indicado por Saremba et al.23, que fue adaptado de un método QuEChERS (AOAC 2007.01, Agilent Inc. ®) según lo indicado por Chang24 para extraer nicotina y sus metabolitos en Trichoplusia ni. Para la preparación de muestras se utilizaron tejidos y heces de cinco larvas. Se homogeneizaron muestras de cuerpo entero y heces de insectos (se preparó 1 g de muestra representativa a partir de 5 larvas) y se extrajeron en una extracción tamponada con acetonitrilo-agua (0,5 ml:0,5 ml). Este extracto se añade al kit de extracción Agilent AOAC y se agita con vórtex para 5 s (el pH se ajustó a 11 usando NaOH) y se centrifugó o 5 min a 5000 rpm. El sobrenadante de los extractos se recogió y se agitó en una columna de limpieza dSPE (AOAC 2007.01) para eliminar pigmentos, lípidos y proteínas y luego se centrifugó durante 5 minutos a 10.000 rpm. La capa sobrenadante superior se recogió y se filtró a través de un filtro de jeringa de PTFE de 0,2 µm para eliminar las partículas y se inyectaron 20 µl en el vial del muestreador automático.

Las hojas de tabaco se extrajeron siguiendo el protocolo utilizado por Li et al.25 con ligeras modificaciones. Se agregaron 250 mg de muestra de hoja con 50 \(\upmu\)l de solución de estándar interno, se homogeneizaron y se filtraron a través de un tamiz de 425 \(\upmu\)m y se extrajeron en acetato de amonio usando el método QuEChERS (AOAC 2007.01, Agilent Inc. ® ) y se centrifugó a 5000 rpm durante 5 min. El extractante se filtra directamente en los viales de inyección utilizando un filtro de jeringa de PTFE de 0,2 \(\upmu\)m.

Se utilizaron soluciones estándar de 1 mg/ml para preparar soluciones madre (de 1 ng/ml a 20 ng/ml) en metanol de grado LC-MS mediante diluciones en serie y se almacenaron a -4 °C hasta su uso posterior. Las curvas de calibración de NNN, NNK y NNAL se dan en el Suplemento 1.

El sistema LC-MS/MS (Agilent 6470B TQ LC/MS) constaba de un UHPLC (Agilent 1290 Infinity II) y un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo con ionización a presión atmosférica (Agilent 6470 LC/TQ) equipado con ionización por pulverización de electrones (ESI) de Agilent. Fuente de corriente en chorro. El UHPLC tiene una columna Zorbax Eclipse Plus-C18 (3 mm de diámetro interior × 100 mm de largo × 1,8 \(\upmu\)m de tamaño de poro). Para la cuantificación de TSNA, se realizó LC-MS/MS con la fase móvil A (agua: ácido fórmico al 0,1 % (2:98 v/v) con pH = 3) y la fase móvil B (metanol al 100 %: ácido fórmico al 0,1 % con pH = 3) a un caudal de 0,5 ml/min (flujo isocrático) acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo con un voltaje capilar de 4000 V, voltaje de boquilla de 500 V, gas nebulizador nitrógeno con una presión de 45 psi, el gas temperatura de 300 °C y temperatura del gas de envoltura de 350 °C y flujo de gas y flujo de gas de envoltura de 8L/min y 11L/min, respectivamente. Se operó en modo positivo por electropulverización y la recolección de datos se realizó en modo MRM. El sistema LC-MS/MS tenía un volumen de inyección de 20 \(\upmu\)l y el tiempo total de ejecución fue de 20 min. La temperatura de la columna se mantuvo a 40 °C. Para el análisis de TSNA se utilizó el método ISO/DIS 19,290:2015.

El análisis de los datos se realizó utilizando el software Lab Solutions (Shimadzu).

Declaración ética: este artículo no contiene ningún estudio que involucre humanos/animales/plantas que necesiten la aprobación del comité de ética. El material vegetal puede estar disponible previa solicitud. El material vegetal utilizado en este estudio cumple con las directrices de la Declaración de Política de la UICN sobre Investigación de Especies en Riesgo de Extinción y la Convención sobre el Comercio de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres. No se obtiene ningún material vegetal de especies en peligro de extinción.

La linealidad se evaluó preparando una solución estándar con diferentes concentraciones con diferentes fases móviles e inyectándolas en el mismo procedimiento operativo. Se descubrió que las curvas de calibración de NNN, NNK y NNAL tienen una relación lineal entre (y) y (x), que se indica en el Suplemento 1. La precisión se evaluó mediante la reproducibilidad y repetibilidad del método, que se representa mediante la desviación estándar relativa ( RSD). Para el control de calidad, se inyectan soluciones de NNN, NNK y NNAL con una concentración de 0,1 ppm en el sistema LC-MS/MS junto con las muestras en blanco. La precisión fue superior al 100% y la precisión es inferior al 5% (suplementario 2).

Los estándares de referencia se aumentaron a 0,001 y 0,005 mg/kg y las recuperaciones obtenidas fueron del 95 al 98 % para los tres TSNA que se probaron. Cuando se añadió a concentraciones de 0,01 a 0,2 \(\upmu\)g/ml (ppm), las recuperaciones medias oscilaron entre 95,49 y 106,70%, 93,20 y 109,73% y 98,19 y 101,74% para NNN, NNK y NNAL, respectivamente ( Suplementario 3). Se calculó que el límite de detección y el límite de cuantificación eran 0,001 y 0,005 mg/kg, respectivamente, para todos los TSNA, a saber. NNN, NNK y NNAL. El % de RSD fue inferior al 2 % para todos los estándares internos probados. Las ecuaciones que muestran la linealidad de los estándares se dan en la Tabla 2. El tiempo de retención de los TSNA y sus niveles en todo el cuerpo y las heces del insecto se dan a continuación en la Tabla 3. El cromatograma de las muestras analizadas también se muestra a continuación en las Figs. 1 y 2.

Cromatograma de muestras en blanco (a) NNN, (b) NNK y (c) NNAL.

Cromatogramas de NNN (103,1 − > 75,1) y NNK (131,0 − > 43,1) en muestras de insectos y tabaco (a) NNN—S. litura de todo el cuerpo, (b) NNN—S. litura heces (c) NNN—hojas de tabaco (d) NNK—S. litura de todo el cuerpo, (e) NNK—S. litura heces (f) NNK: hojas de tabaco.

Se añadió patrón interno (Quinolina-d7) en 6 réplicas a LOQ, es decir, 0,01 ppm y las recuperaciones obtenidas fueron similares a las de los compuestos de interés. Los efectos de la matriz observados como supresión o mejora de iones ocurren generalmente debido a la presencia de compuestos coeluyentes presentes en la misma matriz26. Los efectos de la matriz en la cuantificación de TSNA se evaluaron utilizando una solución de estándar interno mediante el método de infusión posterior a la columna y se encontró que era del 0%. Además, también se agregaron concentraciones conocidas de soluciones de estándar interno a las muestras extraídas y se analizaron para determinar los TSNA y la concentración final mostró que no hay efectos significativos de la matriz en la cuantificación de TSNA.

donde A es el área del pico de un analito en una solución estándar y B es el área del pico del analito en una muestra (blanco enriquecido con analito en la misma concentración que la solución estándar).

Se realizaron estudios de incertidumbre (material complementario 6) sobre los analitos utilizando el procedimiento descrito por Klu et al.27 y las incertidumbres medidas para los estándares de referencia se dan en la Tabla 4. La incertidumbre combinada fue inferior al 7% para todos los analitos. Con un nivel de confianza del 95%, la incertidumbre ampliada para NNK, NNN y NNAL es 0,667, 0,631 y 0,639 \(\upmu\)g/kg, respectivamente.

La cuantificación de TSNA se realizó en monitoreo de reacciones múltiples (modo MR). La fragmentación propuesta de los iones parentales se proporciona en el material complementario 7. Se encontró que NNN era 0,360 ± 0,000631, 0,340 ± 0,000631 y 5,66 ± 0,000631 mg/kg en el cuerpo entero del insecto. heces y hojas de tabaco, respectivamente. Se observó que el NNK fue de 0,060 ± 0,000667, 0,035 ± 0,000667 y 0,093 ± 0,000667 mg/kg en el cuerpo entero del insecto, las heces y las hojas de tabaco, respectivamente. El NNAL estuvo por debajo de los límites cuantificables en los tres especímenes.

NNN y NNK se detectan tanto en el cuerpo entero como en las heces de los insectos. Los datos indican la rápida excreción de los compuestos cancerígenos tan pronto como se forman, de manera similar a la rápida excreción de la nicotina y su metabolito cotinina-N-óxido, como informaron Snyder et al.13. NNAL, un metabolito de NNK, no se detecta ni en todo el cuerpo del insecto ni en las heces, lo que indica que NNK no se metaboliza en S. litura, similar al análisis del metabolismo de la nicotina en el escarabajo de los cigarrillos, Lasioderma serricorne, realizado por Farnham et al.12, que reveló que la nicotina no se secuestra ni se desintoxica, sino que se excreta. Pérez-Ortuño et al.28 informaron que la concentración media de NNN y NNK en el fluido oral de personas que fumaban al menos 1 cigarrillo al día era de 118 y 6,6 pg/ml. Kavvadias et al.29 informaron que la concentración media de NNN en la orina de fumadores era de 7,2 pg/ml. La concentración de NNN que detectamos en larvas de S. litura es de 0,360 mg/kg en todo el cuerpo y de 0,340 mg/kg en las heces de insectos, que es aproximadamente 4778 veces más de lo informado en la orina humana por Kavvadias et al.29. La presencia de TSNA en la orina o el fluido oral humanos se considera un biomarcador de riesgo de cáncer28.

La probabilidad de que un insecto contraiga cáncer es muy baja debido a varios factores. En primer lugar, la vida útil de un insecto promedio es bastante corta para que se desarrolle algún tipo de cáncer; en segundo lugar, los insectos son conocidos popularmente por su potencial de desintoxicación xenobiótica y cualquier agente cancerígeno (como los pesticidas, por ejemplo) podría desintoxicarse. Además, el genoma del insecto es de tamaño pequeño y, por lo tanto, las posibilidades de mutaciones son muy menores. Además, los insectos sufren una muerte celular programada a lo largo de su ciclo de vida cada vez que sufren una metamorfosis que probablemente prevendrá la aparición de tumores30. Pero nuevamente, los insectos también pueden contraer cáncer. La paradoja de Peto establece que no existe correlación entre el tamaño corporal y el riesgo de cáncer31, pero hasta ahora no somos concluyentes para usar esto para responder si los insectos contraen cáncer. Ha habido informes de tumores en insectos que probablemente expliquen esto. Harker32 informó secreciones endocrinas excesivas de tumores inducidos por ganglios suboesofágicos en el intestino medio de Periplaneta americana. Federley33 informó la matanza de machos en las especies híbridas de la mariposa Pygaera pigra (Notodontitade: Lepidoptera). Las larvas masculinas de las especies híbridas mueren debido al cáncer incluso antes de llegar a pupa. Los TSNA son potentes carcinógenos y se ha informado que están asociados con cánceres de pulmón en fumadores5,6. Para determinar si los TSNA poseen un riesgo significativo de cáncer en insectos, se requiere una investigación más profunda. Por ejemplo, pueden usarse líneas celulares de insectos tales como la línea celular Sf9 para evaluar la mutagenicidad de estos compuestos y sus metabolitos en células de insectos.

Las nitrosaminas específicas del tabaco son sustancias cancerígenas y están asociadas con varios tipos de cáncer. Se forman durante el proceso de curación, almacenamiento y fermentación. Los TSNA también pueden formarse en el intestino medio de los insectos que se alimentan de tabaco, donde las hojas de tabaco ingeridas se fermentan. Hemos detectado la presencia de NNN y NNK en todo el cuerpo y en las heces del insecto, lo que indica su formación en insectos que se alimentan de tabaco. Los efectos genotóxicos de los TSNA se informan ampliamente en animales superiores, pero no se ha realizado ningún estudio para investigar los efectos de los TSNA en animales inferiores como los invertebrados. Este estudio impulsa futuras investigaciones sobre cómo se forman, metabolizan y desintoxican (si los hay) los TSNA en los insectos. Este experimento debe realizarse con todos los insectos que se alimentan de tabaco para ver cómo diferentes insectos han desarrollado estrategias para mitigar los efectos genotóxicos de los TSNA en ellos. Para explorar el impacto del riesgo dietético relacionado con sus hábitos alimentarios y la evolución de poderosos mecanismos desintoxicantes xenobióticos en ellos en comparación con los animales superiores, sería útil utilizar insectos que se alimentan de plantas como el tabaco que contienen compuestos peligrosos. .

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria).

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Descargar referencias

Los autores agradecen al Departamento de Entomología de la Universidad Agrícola Central Dr. Rajendra Prasad por su apoyo inquebrantable durante toda la investigación. Los autores desean agradecer al Dr. Molamma P. Prabhakaran, Universidad Nacional de Singapur y al Dr. Matthew William Turnbull, Universidad de Clemson por su ayuda en la revisión y revisión del artículo.

Esta investigación no recibió ninguna subvención específica de agencias de financiación del sector público, comercial o sin fines de lucro.

Estos autores contribuyeron igualmente: Jabez Raju Battu y Somala Karthik.

Departamento de Entomología, Universidad Agrícola CSK Himachal Pradesh, Palampur, Himachal Pradesh, India

Jabez Raju Battu y Himanshu Thakur

Departamento de Entomología, Facultad de Agricultura PG, Universidad Agrícola Central Dr. Rajendra Prasad, Pusa, Bihar, India

Somala Karthik, Gummudala Yashaswini, Alagesan Keerthana, MP Shireesh Kumar y Morthala Shankara Sai Reddy

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JRB: Conceptualización, Metodología, Redacción—Borrador original. SK: Validación, redacción: revisión y edición. GY: Escritura: revisión y edición. HT: Escritura: revisión y edición. AK: Escritura: revisión y edición. MPSK: Escritura: revisión y edición. MSSR: Recursos, Supervisión. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Jabez Raju Battu o Morthala Shankara Sai Reddy.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Battu, JR, Karthik, S., Yashaswini, G. et al. Análisis LC-MS/MS de nitrosaminas cancerígenas específicas del tabaco en Spodoptera litura utilizando el método QuEChERS. Representante científico 13, 12151 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37656-2

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Recibido: 30 de mayo de 2022

Aceptado: 25 de junio de 2023

Publicado: 27 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37656-2

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